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    黃曲霉毒素的測定方法匯總!

    放大字體  縮小字體 發布日期:2022-08-22  瀏覽次數:218
    核心提示: 黃曲霉毒素具有較強的毒害作用,可誘發肝、腎、肺、胃等部位的癌變,黃曲霉毒素B1被公認為是目前致癌力最強的天然物質.藥材
     黃曲霉毒素具有較強的毒害作用,可誘發肝、腎、肺、胃等部位的癌變,黃曲霉毒素B1被公認為是目前致癌力最強的天然物質.

    藥材、飲片及制劑在貯藏、制備、運輸過程中,如保存不當,就會有受潮霉變而污染黃曲霉毒素的可能。

    因此,各藥典都將黃曲霉毒素列為很重要的安全性指標,中國藥典和歐洲藥典對多種中藥材都都建立了黃曲霉素檢查指標,美國藥典對植源性的藥品也要求檢查黃曲霉毒素……

    今天小編就詳細介紹中國藥典、歐洲藥典和美國藥典的黃曲霉毒素測定方法,總結出各藥典的差異,并列出詳細的檢驗方法,供各位參考。

    1、比較中國藥典、美國藥典、歐洲藥典的檢查方法

    各藥典中方法號、限度、適用范圍等列表如下,由此可見,各藥典收載的檢測方法不同、限度不同,最嚴格的當屬歐洲藥典。

    對比內容

    中國藥典

    美國藥典

    歐洲藥典

    依據

    通則2351真菌毒素測定法

    GENERAL CHAPTERS<561>

    ARTICLES OF BOTANICAL ORIGIN

    2.8.18 DETERMINATION OF AFLATOXIN B1 IN HERBAL DRUGS

    方法

    第一法

    HPLC法

    TLC法

    HPLC法

    第二法

    HPLC-MS法

    薄層掃描法

    第三法

    酶聯免疫法

    HPLC法

    限度

    每1000g含黃曲霉毒素B1不得過5μg ,總量不得過 10μg。

    每1000g含黃曲霉毒素B1不得過5μg,總量不得過20μg。

    每1000g含黃曲霉毒素B1不得過2μg,總量不得過4μg。

    說明

    中國藥典的三種方法都可以使用,當測定結果超出限度時,采用第二法進行確認。

    首先使用第一法,第一法系統適用性不通過才會使用第二法或第三法。

    只有一種方法,適用于devil’s claw root, ginger and senna   pods,用于其他品種需要驗證適用性。

    注:總量為黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)和黃曲霉毒素G2(AFG2)的總量。

    2、詳解中國藥典、美國藥典、歐洲藥典的HPLC方法

    黃曲霉毒素檢查方法中,唯一同時適用于三家藥典的方法,只有HPLC法(熒光檢測器),而且光化學檢測器與HPLC-熒光檢測器配套使用,在線對黃曲霉毒素B1、G1進行衍生,不需要任何化學試劑,應用范圍較廣,因此本文重點比較此法在各藥典中的異同。

    從以下幾部分可以看出,色譜柱、流動相、流速、波長、供試品和對照品的配制方法、進樣量等內容都存在較大差異,需要謹慎對照使用。

    2.1 中國藥典中黃曲霉毒素檢查方法(HPLC法)

    檢驗方法

    具體內容

    色譜柱

    十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑

    流動相

    甲醇-乙腈-水(40 : 18 : 42)

    流速

    1.0ml/min

    柱后衍生化

    光化學衍生器(254nm)

    檢測器

    熒光檢測器,激發波長360nm (或365nm),發射波長450nm。

    系統適用性

    兩個相鄰色譜峰的分離度應大于1.5;需確認回收率應在60~120%,線性回歸的相關系數應不低于0.990;

    混合對照品溶液

    精密量取黃曲霉毒素混合對照品溶液(黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2 標示濃度分別為 1.0μg/ml、0. 3μg/ml、l.0μg/ml、0.3μg/ml)0.5ml,置10ml量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,作為貯備溶液。精密量取貯備溶液l ml,置25ml量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,即得。

    供試品溶液

    取供試品粉末約15g(過二號篩),精密稱定,置于均質瓶中,加入氯化鈉3g,精密加入70%甲醇溶液75ml, 高速攪拌2 分鐘(攪拌速度大于11000 r/min),離心 5 分鐘(離心速度4000r/min),精密量取上清液15ml, 置50ml量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,離心 10分鐘(離心速度4000r/min),精密量取上清液20ml,通過免疫親合柱,流速每分鐘3ml, 用水20ml洗脫(必要時可以先用淋洗緩沖液10ml洗脫,再用水10ml洗脫),棄去洗脫液,使空氣進人柱子,將水擠出柱子,再用適量甲醇洗脫, 收集洗脫液,置 2ml量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0. 22μm)濾過,取續濾液,即得。

    進樣量

    混合對照品溶液5μ1、10μ1、15μ1、20μ1、25μ1;供試品溶液20~50μl。

    定量方法

    測定各對照品溶液的峰面積,以峰面積為縱坐標,以進樣量為橫坐標,繪制標準曲線;測定供試品溶液的峰面積,從標準曲線上讀出供試品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量,并計算出四者總和。

    2.2 美國藥典中黃曲霉毒素檢查方法(HPLC法)

    檢驗方法

    具體內容

    色譜柱

    4.6-mm×15   cm,3-μm填料L1(即十八烷基硅烷鍵合硅膠)

    流動相

    水-甲醇-乙腈(60:25:15)

    流速

    0.8   mL/min

    檢測器

    熒光檢測器,激發波長362nm,發射波長440nm

    系統適用性

    洗脫順序為AFG2、AFG1、AFB2和AFB1;

    將5號線性對照溶液5ml加入到5g的樣品中,按“供試品溶液”(甲醇-0.5%碳酸氫鈉(7:3)用量為20ml)處理方法,計算AFB1(2μg/kg)和黃曲霉毒素(5μg/kg)的平均回收率,應分別不低于68%和70%。AFB1和黃曲霉毒素總量的相對標準偏差(RSD)不高于10%。

    免疫親和柱預處理

    免疫黃曲霉素柱的總黃曲霉毒素最小容量不低于100ng。將AFB1、AFB2、AFG1和AFG2每個5ng,溶于10mL 10%甲醇的磷酸鹽緩沖鹽溶液(v/v)中時,各回收率不低于80%。

    對照品溶液

    用乙腈制備AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分別含有2.0、0.50、2.0和0.50μg/ml的混合對照溶液。首先用乙腈制備標示濃度均為10μg/ml的各儲備液,在360nm附近測定最大吸光度,計算公式為:黃曲霉毒素濃度(μg/ml)=(A×Mr×1000)/ε,其中A為吸光度,Mr為分子量,ε為摩爾吸收系數,見附表1。準確量取一定量黃曲霉毒素各儲備液至同一容量瓶,用乙腈稀釋至規定濃度。冰箱儲存,使用前平衡至室溫。用甲醇-水(1:1)稀釋黃曲霉素對照溶液,最終濃度見附表2。冰箱保存,使用前平衡至室溫,每日新制。

    供試品溶液

    取樣品5g,置于50ml離心管中,加入氯化鈉1 g和甲醇-0.5%碳酸氫鈉(7:3)25 mL。在渦流混合器上混合,直到樣品顆粒和提取溶劑充分混合,400 rpm振搖10min,7000 rpm離心10min,立即取7 mL至50 mL離心管中,加入0.1 M磷酸鹽緩沖溶液28 mL,混合,過濾,收集25ml濾液(相當于1g樣品)到25ml刻度量筒中,并立即上IAC柱。[注:對于IAC柱在使用前必須在室溫下至少平衡15分鐘。]從小柱上取下頂蓋,并將其與儲液罐連接。從柱上拆下端蓋,并將其連接到柱歧管上(必須擰緊)。讓柱中的液體通過,直到液體高出柱床約2~3 mm。將濾液25ml倒入儲液罐。讓液體自然流過柱子,讓柱子流干。為了便于再次開始流動,從歧管上取下色譜柱,向柱中加入磷酸鹽緩沖鹽溶液約2 mL,將色譜柱重新連接到儲液罐上,然后用磷酸鹽緩沖鹽溶液3ml和水5ml清洗色譜柱(如果使用其他技術去除柱末端的氣泡并很容易重新開始流動,則可將磷酸鹽緩沖鹽溶液5ml直接加入到柱儲液罐中)。讓柱子流干,然后用注射器注入3ml空氣通過柱子,用甲醇1ml洗脫,并用3ml容量瓶中收集洗脫液,使洗脫液自由滴落。讓柱子流干。靜置1分鐘,然后用額外的甲醇1ml洗脫,并收集在同一容量瓶中。讓柱子流干,并注入10ml空氣通過柱子,用水稀釋洗脫液至刻度,立即進行分析。

    進樣量

    50μ1

    定量方法

    毒素(μg/kg)={[(R−a)/S]×V/W}×F

    R=樣品溶液的峰面積;a=校準曲線的y截距;S=校準曲線的斜率;V=樣品溶液的最終體積(mL);W=通過免疫柱的供試品1g;F=稀釋系數,V=3 mL時為1;黃曲霉毒素的總量是AFG1、AFG2、AFB1和AFB2的總和。

    2.3 歐洲藥典中黃曲霉毒素檢查方法(HPLC法)

    檢驗方法

    具體內容

    色譜柱

    柱長0.25m,直徑4.6mm,十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相(5-μm)

    流動相

    乙腈-甲醇-水(2:3:6)

    流速

    1.0ml/min

    柱后衍生化

    光化學衍生器(254nm)

    檢測器

    熒光檢測器檢測,激發波長= 365nm,發射波長Aem =435nm。

    系統適用性

    出峰順序:G2、G1、B2、B1;需滿足驗證要求。

    對照品溶液

    用甲苯-乙腈(98:2)制備10μg/mLAFB1貯備溶液,并在330nm~370nm波長范圍內測定吸收曲線,計算公式為:黃曲霉毒素濃度(μg/mL)=(A×M×100)/ε,其中A為紫外吸收曲線上的最大吸光度,M為B1的分子量(312g/mol),ε為摩爾吸收系數(1930m2/mol)。用甲苯-乙腈(98:2)將初級貯備液稀釋為100ng/mL的次級貯備液,用鋁箔緊密包好后,置于4℃儲存,使用前,待溶液恢復至室溫后才能取下鋁箔。使用前后記錄容量瓶的重量。按附表3制備系列對照溶液,將所需體積的次級貯備液置于250ml容量瓶中,氮氣吹干,加入甲醇75ml溶解黃曲霉毒素B1,并用水稀釋至刻度。

    免疫親和柱預處理

    免疫親和柱對黃曲霉毒素B1的容量不低于100 ng。將AFB1 5 ng,溶于12.5ml甲醇和87.5 mL 水中時,回收率不低于80%。使用前平衡至室溫。

    供試品溶液

    取本品粉末5.00g,加入甲醇:水(70:30)混合溶液100ml,超聲處理30min,取濾液10ml至150ml錐形瓶,并加入水70ml。取40ml以流速3ml/min(不得超過5ml/min)通過免疫親和柱。用水以流速5ml/min沖洗小柱兩次,每次10ml.用注射器注入空氣10s。取甲醇5ml注入小柱,并保持自然流出,收集洗脫液至5ml容量瓶中,1min后,注入甲醇0.5ml ,再隔1min后,注入甲醇0.5ml,每次加入甲醇后,均通過注入空氣收集洗脫液,用水稀釋至容量瓶刻度,搖勻。溶液澄清的話,可直接用于分析;否則應過濾處理,并確保黃曲霉毒素沒有損失。

    進樣量

    500μ1

    定量方法

    用黃曲霉毒素B1系列對照溶液1~5做標準曲線,樣品濃度超出線性范圍,則需要做相應稀釋。

    毒素(μg/kg)=[(R−b)/a]×V /W

    R=樣品溶液的峰面積;b=校準曲線的截距;a=校準曲線的斜率;V稀釋倍數;W=通過免疫柱的供試品g;黃曲霉毒素的總量是AFG1、AFG2、AFB1和AFB2的總和。

    2.4 上述方法中的三個附表

    附表1

    黃曲霉毒素

    M

    溶劑

    ε

    AFB1

    312

    乙腈

    20700

    AFB2

    314

    乙腈

    22500

    AFG1

    328

    乙腈

    17600

    AFG2

    33

    乙腈

    18900

    附表2

    序號

    黃曲霉素對照溶液加入量(μl)

    黃曲霉素工作對照溶液(ng/ml)

    AFB1

    AFB2

    AFG1

    AFG2

    總和

    1

    0

    0

    0

    0

    0

    0

    2

    12.5

    0.25

    0.0625

    0.25

    0.0625

    0.625

    3

    25

    0.5

    0.125

    0.5

    0.125

    1.25

    4

    50

    1

    0.25

    1

    0.25

    2.5

    5

    100

    2

    0.5

    2

    0.5

    5

    6

    200

    4

    1

    4

    1

    10

    附表3

    系列對照溶液

    加入次級貯備液的體積(μl)

    對照溶液的最終濃度(ng/ml)

    1

    125

    0.05

    2

    250

    0.1

    3

    500

    0.2

    4

    750

    0.3

    5

    1000

    0.4

    3、注意事項

     

    由于黃曲霉毒素的毒性,實驗過程必須小心謹慎,小編總結出4條注意事項,供大家參考:
    1、使用真菌毒素對照品,必須穿好防護服,帶好手套,在通風櫥內進行,并將工作臺蓋上膠布。非實驗人員未經允許,不得進入實驗室,以免發生意外。
    2、黃曲霉毒素容易光降解,實驗過程需要避光,對照品和供試品溶液也需要避光保存,線性對照溶液需要臨用現配。
    3、真菌毒素為痕量分析,易受環境污染,應隨行進行空白試驗與加樣回收率實驗。
    4、用過的玻璃儀器需用次氯酸鈉溶液浸泡2小時。

     

     

    文章(文字):實驗室儀器分析。

    編輯:songjiajie2010

     
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